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承办单位: 贵州大学     

基本信息

项目名称:
HMGB1对HTVL-1病毒Tax蛋白表达的T细胞中NF-κB活性的影响
小类:
生命科学
简介:
为了研究作为重要炎症因子的高迁移率组蛋白(HMGB1)是否与成人T淋巴细胞白血病(ATL)的发病有关,我们构建了HMGB1的真核表达载体,并研究其与Tax蛋白及NF-κB的活性之间的关系,以期以新的思路为ATL的发病甚至临床检测治疗提供理论依据。
详细介绍:
构建人高迁移率组蛋白(HMGB1)的真核表达载体,转入TaxP及TaxN细胞进行表达,并研究其对Tax蛋白表达的T细胞中NF-κB活性的影响。进而为临床研究HMGB1与成人T淋巴细胞白血病(ATL)的发病甚至临床检测治疗提供理论依据。

作品专业信息

撰写目的和基本思路

目的:构建人HMGB1真核表达载体,并研究其对Tax蛋白表达的T细胞中NF-κB活性的影响。进而为临床研究HMGB1与成人T淋巴细胞白血病的发病提供依据。 思路:1.人HMGB1真核表达载体的构建 2.RT-PCR检测HMGB1、p65及Tax基因mRNA 3.Western blot检测HMGB1及p65蛋白 4.荧光素酶检测NF-κB活性 5.统计学分析

科学性、先进性及独特之处

本实验特别地从HMGB1和 HTLV-1病毒Tax蛋白表达的T细胞中NF-κB活性的关系出发,由构建HMGB1真核表达载体入手,经RT-PCR、Western blot、荧光素酶检测等多种分子生物学方法论证,对HMGB1进行了一系列的研究。实验证实了Tax蛋白可以促进HMGB1的蛋白表达,也提示NF-κB活性和HMGB1表达呈正相关,而为进一步研究HMGB1在ATL发病中的作用奠定理论基础。

应用价值和现实意义

Tax蛋白是由成人T淋巴细胞1型病毒(HTLV-1)的Tax基因编码,在成人T淋巴细胞白血病(ATL)发病早期其关键作用,研究已表明,Tax蛋白可以最终导致HTLV-1病毒感染细胞最终发展为ATL细胞,这可能是ATL的发病的主要机制。为此我们准备构建HMGB1的真核表达载体,并研究其与Tax蛋白及NF-κB的活性之间的关系,以期以新的思路为ATL的发病提供理论依据。

学术论文摘要

摘要 目的:构建人高迁移率组蛋白1(high mobility group box-1,HMGB1)的真核表达载体,转入TaxP及TaxN细胞进行表达并研究其对Tax蛋白表达的T细胞中NF-KB活性的影响。方法:用RT-PCR方法扩增人T淋巴细胞系Jurkat细胞中HMGB1的cDNA,连接于真核表达载体pcDNA3.0;将pcDNA3.0-HMGB1转染TaxP及TaxN细胞,48h后检测RT-PCR检测HMGB1和Tax mRNA的表达,HMGB1及p65蛋白的表达;将pcDNA3.0-HMGB1和NF-κB报告基因共转染TaxP及TaxN细胞48h后检测荧光素酶活性。 结果:成功构建了重组表达质粒pcDNA3.0-HMGB1;Tax可以促进HMGB1 mRNA和蛋白的表达;HMGB1可以促进p65 mRNA和蛋白的表达,并与上调NF-κB活性。 结论:HMGB1能协同Tax蛋白激活NF-κB

获奖情况

《中国免疫学》杂志2010年第11期第26卷 发表文章 “HMGB1对HTLV-1病毒Tax蛋白表达的T细胞中NF-κB活性的影响”

鉴定结果

参考文献

一、相关技术: 1.载体的构建 (1)质粒的制备及纯化(2)DNA的限制性内切酶酶切技术 (3)DNA重组技术(4)DNA凝胶电泳,从凝胶中回收纯化DNA 2.产物的检测 (1)RT-PCR技术(2)Western blot印迹法(3)细胞培养 (4)脂质体介导的基因转染技术 3.统计学分析方法 二、相关文献: [1]Yang H, Wang H, Czura CJ, et a1. The cytokine activity of HMGB1[J]. J Leukoc Biol, 2005, 78(1):l-8. [2] Scaffidi P, Misteli T, Bianchi ME. Release of chromat protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation[J]. Nature, 2002, 418(6894):191-195. [3]Peloponese J M Jr,Yasunaga J,Kinjo T, et a1. Peptidylproline cis-trans-isomerase Pinl interacts with human T cell leukemia virus type 1 tax and modulates its activation of NF-kappaB[J].J Virol,2009;83(7):3238-3248. [4] 夏云, 石瑛, 高琰 等。Tax基因表达细胞系的建立及其生物学活性的初步研究。中国实验血液学杂志, 2008; 16(6):1425-1429. [5]Reinhard, E.Voll, Vilma Urbonaviciute, et al. High Mobility Group box 1 in the Pathogenes is of Inflammatory and Auto immune Diseases[J]. IMAJ, 2008, 10(25):26-28 等

同类课题研究水平概述

HMGBl作为重要的晚期炎症介质,目前已经进行了多方位的研究。然而,HMGBl对肿瘤细胞的生物学影响及机制,尚待探讨。在一些肿瘤,如非小细胞癌、胰腺癌、乳腺癌等发生时都有HMGBl过表达的出现,当前研究表明,HMGBl与肿瘤的发生、发展、新生血管的形成和肿瘤细胞的生长、浸润、转移、增殖、凋亡及耐药的形成等密切相关。那HMGB1会不会与ATL发病甚至治疗相关呢? 研究表明,成人T淋巴细胞1型病毒(HTLV-1)主要侵犯人CD4+T淋巴细胞,HTLV1型病毒的tax基因编码的Tax蛋白在病毒侵犯T细胞后可明显促进其活化并最终导致病毒感染细胞转化为成人T淋巴细胞白血病(adult T-cell leukemia, ATL)细胞。本实验表明TaxP细胞HMGB1的mRNA和蛋白的表达明显高于TaxN细胞,NF-κB活性也明显高于TaxN细胞,另外NF-κB亚基p65的mRNA和蛋白表达也明显高于TaxN细胞,统计学分析也提示NF-κB活性和HMGB1表达呈正相关,这提示Tax作为HTLV1型病毒编码的重要蛋白,可以导致CD4+T细胞活化,这与国外及本实验室报道相一致。同时活化后的T细胞HMGB1表达高于Tax阴性的TaxN细胞,这提示Tax可以促进HMGB1的表达,但是由于Tax蛋白主要存在于早期病毒感染的细胞,而60%病人的ATL细胞并不能检测到Tax蛋白的存在,所以Tax蛋白促进HMGB1的表达应该在病毒感染早期即炎症阶段,可能通过自分泌和(或)旁分泌作用于自身或邻近的T细胞,并于T细胞膜表面的RAGE、TLR4、TLR2结合进而刺激NF-κB的活化,活化的NF-κB可促进炎症介质的释放,而炎症介质的释放必将正反馈第导致NF-κB的持续活化,另外高表达的HMGB1作为核内的一种非组蛋白,可以通过与双链螺旋状DNA的小沟结合稳定DNA结构,使得病毒感染细胞存活期延长,最终使得病毒感染细胞发展为ATL细胞。由于HMGB1蛋白和NF-κB的正相关,且HMGB1的过表达并不会影响Tax mRNA的表达,多数认为尽管HMGB1参与Tax对NF-κB的活化,可是HMGB1并不会正反馈促进Tax基因的表达。尽管Tax可以促进HMGB1表达,但是HMGB1在ATL发病中究竟扮演什么角色仍需要进一步研究。
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